猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒的制作方法
猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物和检测试剂盒。所述检测用引物为序列表SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：4，本发明还提供了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。本发明所选引物特异性强，且能同时检测三种病原，节约成本、减少步骤，提高效率。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、稳定性好的特点。
【专利说明】猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状，常与其他猪病混合感染危害严重，防治十分困难。近年来研究表明感染猪的附红细胞体的种类有两种，猪附红细胞体(Mycoplasma suis MS)和小附红细胞体(Mycoplasma parvum MP),原来归于立克兹氏体目质体科，近年来根据16Sr RNA基因的序列分析和电镜的观察结果，将附红细胞体划分到支原体属的嗜血支原体。我们在附红细胞体感染的猪体内分离到第三种感染猪的新附红细胞体病原，并在Genbank上公布了其16S rRNA和rnpB基因序列(登录号 JX489600 和 JX489603),暂定名为未定种附红细胞体(Candidate mycoplasma haemosuisCMH)。由于嗜血支原体都不能够纯培养，对其研究造成很大的困难。目前临床上主要依靠显微镜检查鲜血压片和姬姆萨染色片进行诊断，这些方法存在滞后性和显著的假阳性，实验室诊断方法有检测抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和检测病原的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法，但现有的诊断方法主要针对的病原为猪附红细胞体MS，对其他两种病原体MP和CMH的诊断方法尚未有报道。同时根据我们的临床调查发现，在我国浙江上海安徽等地区感染猪的附红细胞体种类主要为MP而并非国内外研究较多的MS。为了能够明确这类病原的致病性和致病机理，亟需可以诊断三种病原的诊断方法。
[0003]本发明首次将P CR技术应用于同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测领域，提供了针对猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测的特异性引物、试剂盒和检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸序列。
[0005]本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0007]本发明提供了检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测引物，具体如下:
[0008]通过序列比较分析，根据猪附红细胞体ZJ NBOl株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号:KC907396)保守区199-582位置和小附红细胞体ZJ JX9330株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号:HQ489599)保守区198-581位置设计一对通用引物:
[0009]I)MP 和 MS 正义引物(MF)[0010]5’ TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3’ (SEQ ID NO:1)；
[0011]2) MP 和 MS 反义引物(MR)
[0012]5’ TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3’ (SEQ ID NO:2)；
[0013]其中，M代表兼并碱基A或C ;
[0014]扩增目的片段为384bp，扩增到MS序列如序列表SEQ IDNO:5所示；
[0015]其中，21bp处M代表兼并碱基A或C。
[0016]扩增到MP序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
[0017]通过序列比较，根据未定种附红细胞体CMH已公布的ZJ SXSYl 102株16Sr RNA基因序列(GenBank:JX489600)，在其保守区441-972位置设计一对引物:
[0018]3) CMH 正义引物(CMHF)
[0019]5’ AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’ (SEQ ID NO:3)；
[0020]4) CMH 反义引物(CMHR) [0021]5’ CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’ (SEQ ID NO:4)；
[0022]扩增目的基因大小为532bp,序列如序列表SEQ ID NO:7所不；
[0023]其中，490bp处M代表兼并碱基A或C。
[0024]本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，由以下组分组成:
[0025]1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的血液DNA提取试剂盒，例如杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNA Mini kit, Cat.N0.3001050)；
[0026]2)DNA标准品:含猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和含未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒；
[0027]3) PCR反应液，其包括:PCR缓冲液，dNTP, Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物；
[0028]优选使用=IXPCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物
0.2 μ M、反义引物0.2 μ M和未定种附红细胞体正义引物0.2 μ M、反义引物0.2 μ M，Taq DNA聚合酶1U，dNTP ；
[0029]所述Taq DNA聚合酶为TakaRa Taq?，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DROOlA0所述引物均委托上海英潍捷基贸易有限公司合成。
[0030]4)阴性对照:DEPC水；
[0031]5)DEPC水；lmL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0ΜΩ.CM。
[0032]6)电泳观察结果:5 μ L PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结
果O
[0033]其中，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
[0034]本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒的使用方法:[0035]1.样品采集、运送及制备
[0036]具苍白贫血发热等症状的病猪，采集抗凝血l_2mL，置于4°C保鲜盒中，运送回实验室。-4 °C保存备用。
[0037]2.DNA 提取
[0038]按照全血DNA提取试剂盒试剂盒提供的方法提取病原DNA，具体方法如下:
[0039](I)取300 μ I缓冲液LI移入到1.5ml离心管中；
[0040](2)加入400 μ I全血，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
[0041](3)加入300 μ I缓冲液L2，剧烈摇晃离心管3-5次，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
[0042](4) 13000rpm 离心 2min ；
[0043](5)将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中，盖上管盖，置于2mL收集管中，12000rpm 离心 30s ；
[0044](6)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入500 μ L缓冲液WA，盖上管盖，12000rpm离心30s ；
[0045](7)弃去收集 管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入600 μ L缓冲液WB，盖上管盖，12000rpm离心30s ；
[0046](8)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，HOOOrpm离心Imin ；
[0047](9)弃去收集管，把柱子放进一个洁净的1.5ml离心管中，加入100 μ 156°C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温放置lmin，12000rpm离心lmin，1.5ml离心管中即为病原DNA，可立即用于PCR反应，或者_20°C保存备用。
[0048]3.聚合酶链式反应PCR:
[0049]200 μ I PCR反应管，设置阴性对照管和阳性对照管，其余为样品检测管。
[0050]反应体系为25 μ L,见表1:
[0051]表1
【权利要求】
1.一组检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸引物，其特征在于，所述核苷酸引物为序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4，其中序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2分别为检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别为检测未定种附红细胞体的正义引物和反义引物。
2.一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成: 1)DNA提取试剂； 2)DNA标准品； 3)PCR反应液，其包括:PCR缓冲液，dNTP,Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检 测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物； 4)阴性对照:DEPC水；
5)DEPC 水； 其中，检测猪附红细胞体、小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标准品包括猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒。
5.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括I X PCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物0.2 μ M、反义引物0.2 μ M，检测未定种附红细胞体的正义引物0.2 μ M、反义引物 0.2 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 IU，dNTP。
【文档编号】C12Q1/04GK104004847SQ201410253400
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】付媛, 石团员, 方维焕, 徐丽华, 袁秀芳, 李军星, 卢福庄, 张雪娟, 舒琦艳, 魏巍, 周永学 申请人:浙江省农业科学院
【专利摘要】本发明公开了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物和检测试剂盒。所述检测用引物为序列表SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：4，本发明还提供了猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。本发明所选引物特异性强，且能同时检测三种病原，节约成本、减少步骤，提高效率。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、稳定性好的特点。
【专利说明】猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测用引物及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状，常与其他猪病混合感染危害严重，防治十分困难。近年来研究表明感染猪的附红细胞体的种类有两种，猪附红细胞体(Mycoplasma suis MS)和小附红细胞体(Mycoplasma parvum MP),原来归于立克兹氏体目质体科，近年来根据16Sr RNA基因的序列分析和电镜的观察结果，将附红细胞体划分到支原体属的嗜血支原体。我们在附红细胞体感染的猪体内分离到第三种感染猪的新附红细胞体病原，并在Genbank上公布了其16S rRNA和rnpB基因序列(登录号 JX489600 和 JX489603),暂定名为未定种附红细胞体(Candidate mycoplasma haemosuisCMH)。由于嗜血支原体都不能够纯培养，对其研究造成很大的困难。目前临床上主要依靠显微镜检查鲜血压片和姬姆萨染色片进行诊断，这些方法存在滞后性和显著的假阳性，实验室诊断方法有检测抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和检测病原的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法，但现有的诊断方法主要针对的病原为猪附红细胞体MS，对其他两种病原体MP和CMH的诊断方法尚未有报道。同时根据我们的临床调查发现，在我国浙江上海安徽等地区感染猪的附红细胞体种类主要为MP而并非国内外研究较多的MS。为了能够明确这类病原的致病性和致病机理，亟需可以诊断三种病原的诊断方法。
[0003]本发明首次将P CR技术应用于同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测领域，提供了针对猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测的特异性引物、试剂盒和检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸序列。
[0005]本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0007]本发明提供了检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体检测引物，具体如下:
[0008]通过序列比较分析，根据猪附红细胞体ZJ NBOl株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号:KC907396)保守区199-582位置和小附红细胞体ZJ JX9330株16Sr RNA基因序列(GenBank登录号:HQ489599)保守区198-581位置设计一对通用引物:
[0009]I)MP 和 MS 正义引物(MF)[0010]5’ TAAATTAAAGGAGGCTGCCGMAAGGTG3’ (SEQ ID NO:1)；
[0011]2) MP 和 MS 反义引物(MR)
[0012]5’ TACGCCCAATAAATCCGGATAATGCTC3’ (SEQ ID NO:2)；
[0013]其中，M代表兼并碱基A或C ;
[0014]扩增目的片段为384bp，扩增到MS序列如序列表SEQ IDNO:5所示；
[0015]其中，21bp处M代表兼并碱基A或C。
[0016]扩增到MP序列如序列表SEQ ID NO:6所示；
[0017]通过序列比较，根据未定种附红细胞体CMH已公布的ZJ SXSYl 102株16Sr RNA基因序列(GenBank:JX489600)，在其保守区441-972位置设计一对引物:
[0018]3) CMH 正义引物(CMHF)
[0019]5’ AAACTCTGATGGTACCTCCTGAATAAGTGA3’ (SEQ ID NO:3)；
[0020]4) CMH 反义引物(CMHR) [0021]5’ CCTTCGCTGGGGATGTCAAACCT3’ (SEQ ID NO:4)；
[0022]扩增目的基因大小为532bp,序列如序列表SEQ ID NO:7所不；
[0023]其中，490bp处M代表兼并碱基A或C。
[0024]本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，由以下组分组成:
[0025]1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的血液DNA提取试剂盒，例如杭州新景生物技术开发有限公司的全血DNA提取试剂盒(Blood DNA Mini kit, Cat.N0.3001050)；
[0026]2)DNA标准品:含猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和含未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒；
[0027]3) PCR反应液，其包括:PCR缓冲液，dNTP, Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物；
[0028]优选使用=IXPCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物
0.2 μ M、反义引物0.2 μ M和未定种附红细胞体正义引物0.2 μ M、反义引物0.2 μ M，Taq DNA聚合酶1U，dNTP ；
[0029]所述Taq DNA聚合酶为TakaRa Taq?，购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DROOlA0所述引物均委托上海英潍捷基贸易有限公司合成。
[0030]4)阴性对照:DEPC水；
[0031]5)DEPC水；lmL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0ΜΩ.CM。
[0032]6)电泳观察结果:5 μ L PCR反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结
果O
[0033]其中，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
[0034]本发明还提供了一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒的使用方法:[0035]1.样品采集、运送及制备
[0036]具苍白贫血发热等症状的病猪，采集抗凝血l_2mL，置于4°C保鲜盒中，运送回实验室。-4 °C保存备用。
[0037]2.DNA 提取
[0038]按照全血DNA提取试剂盒试剂盒提供的方法提取病原DNA，具体方法如下:
[0039](I)取300 μ I缓冲液LI移入到1.5ml离心管中；
[0040](2)加入400 μ I全血，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
[0041](3)加入300 μ I缓冲液L2，剧烈摇晃离心管3-5次，在漩涡振荡器上混匀(30s)；
[0042](4) 13000rpm 离心 2min ；
[0043](5)将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中，盖上管盖，置于2mL收集管中，12000rpm 离心 30s ；
[0044](6)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入500 μ L缓冲液WA，盖上管盖，12000rpm离心30s ；
[0045](7)弃去收集 管中的滤液，把柱子放置回收集管，在柱子中加入600 μ L缓冲液WB，盖上管盖，12000rpm离心30s ；
[0046](8)弃去收集管中的滤液，把柱子放置回收集管，HOOOrpm离心Imin ；
[0047](9)弃去收集管，把柱子放进一个洁净的1.5ml离心管中，加入100 μ 156°C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温放置lmin，12000rpm离心lmin，1.5ml离心管中即为病原DNA，可立即用于PCR反应，或者_20°C保存备用。
[0048]3.聚合酶链式反应PCR:
[0049]200 μ I PCR反应管，设置阴性对照管和阳性对照管，其余为样品检测管。
[0050]反应体系为25 μ L,见表1:
[0051]表1
【权利要求】
1.一组检测猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的核苷酸引物，其特征在于，所述核苷酸引物为序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4，其中序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2分别为检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别为检测未定种附红细胞体的正义引物和反义引物。
2.一种猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成: 1)DNA提取试剂； 2)DNA标准品； 3)PCR反应液，其包括:PCR缓冲液，dNTP,Taq DNA聚合酶，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物、反义引物，检 测未定种附红细胞体的正义引物、反义引物； 4)阴性对照:DEPC水；
5)DEPC 水； 其中，检测猪附红细胞体、小附红细胞体的正义引物为序列表SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列；检测未定种附红细胞体的正义引物为序列表SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ IDNo:4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。
4.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标准品包括猪附红细胞体靶基因的T载体质粒和未定种附红细胞体靶基因的T载体质粒。
5.根据权利要求2所述的猪附红细胞体、小附红细胞体和未定种附红细胞体的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括I X PCR缓冲液，检测猪附红细胞体和小附红细胞体的正义引物0.2 μ M、反义引物0.2 μ M，检测未定种附红细胞体的正义引物0.2 μ M、反义引物 0.2 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 IU，dNTP。
【文档编号】C12Q1/04GK104004847SQ201410253400
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】付媛, 石团员, 方维焕, 徐丽华, 袁秀芳, 李军星, 卢福庄, 张雪娟, 舒琦艳, 魏巍, 周永学 申请人:浙江省农业科学院
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